中国云南普洱茶熟茶后发酵臭曲霉的生物学特性研究

    摘要：为了开发云南普洱茶熟茶生产的规范技术，对云南普洱茶后发酵过程中的优势菌之易曲霉的生物学特征进行实验研究。结果表明，该菌株对酸碱度有广泛的适应性；在与硫酸铵或豆饼粉为氮源，以玉米粉或果胶为碳源的培养基中生长迅速；培养温度以30℃最为适宜。同时，对菌落的生长规律及形态特征进行了观察与分析。研究结果对该菌的大量培养，以及云南普洱茶的规范化生产技术提供了基础。

    关键词：臭曲霉；生；长温度；碳源；氮源；培炎基

    云南普洱熟茶是以云南特产大叶茶的晒青毛料为原料经后发酵在加工生产的茶类，以特有的风味和历史文化内涵引起注视，逐渐成为脍炙人口的新的方式心差茶饮品，有着巨大的发展潜力。普洱熟茶的生产以渥堆的方式，依靠环境微生物的自然感染，代多种微生物的参与下进行。微生物在普洱熟茶的生产及品质的形成中起着十分重要的作用。20世纪80年代陈宗道等〔1988〕报道从普洱茶中分离到黑曲霉，并认为黑曲霉约占微生物总数的80%左右。周红杰等〔2004〕亦认为黑曲霉是普洱茶渥堆中始终存在的主要菌种。陈可可2006年曾对云南省各个普洱熟茶生产地区渥堆过程中的微生物菌群进行系统的分离和鉴定，并发现共性的优势菌群。经菌物学鉴定，主要的优势群种为曲霉属的真菌，但为发现黑曲霉。其中，臭曲霉(Aaspergillus foetidus Thom etRaper)为主要的优势群菌之一。我们还发现用含有臭曲霉的“普洱茶麴”发酵生产的普洱熟茶汤色红润，茶香浓郁，滋味独特，并能缩短后发酵生产过程，使产品具有稳定的风味与质量。显然，优势菌直接影响普洱茶的生产过程以及产品的品质。为了揭示微生物普洱茶后发酵过程中的作用与机制，我们开展了优势菌群的生物学特性及其对茶多酚等茶叶化合物的转化作用研究。同时，从后发酵生成技术规范和普洱熟茶新品牌构建的角度，开展了“普洱茶麴”在普洱熟茶生产中的应用的研究与开发。本文报道臭曲霉的生物学特征的实验研究结果。

    1、材料与方法

    1、1试验材料

    1、1、1试验样品：该实验所用的臭曲霉(Aaspergillus foetidus Thom etRaper)菌株为云南省产茶区普洱熟茶渥堆中茶堆中采样分离得到的。

    1、1、2氮源实验培养基配方：以改良PDA培养基为基本培养基。分别加入蛋白陈5克(N1)，牛肉糕5克(N2)，酵母浸膏5克(N3)，硝酸钠2克(N4)，硫酸铵2克(N5)，麸皮5克(N6)，豆饼粉5克(N7)等含有机氮和无机氮的物质。

    1、1、3碳源培养基配方：以改良PDA培养基为基本培养基。分别加入蔗糖10克(C1)，麦芽糖10克(C2)，玉米粉10克(C3)，d-果糖10克(C4)，a-乳糖10克(C5)等含有机碳或无机碳的物质。

    1、1、4培养温度的设置：将菌种接种在准备好的PDA固体培养基中，置于20℃,30℃,40℃,50℃,60℃的条件下分别进行培养，观察菌丝体的生长状况。

    1、1、5酸碱度的设置：将菌种分别接种在PH值1~13梯度范围的PDA固体培养基中，置于30℃的条件先进行黑暗培养并观察菌丝体的生长状况。

    1、2实验方法

    在超净工作台内，用接种针均匀挑取经转化合化2次的臭曲霉孢子，接种于事先准备好的固体培养基中。除温度因素实验外，酸碱度实验、氮天源实验和碳源实验均于30℃条件下黑暗培养。接种后第2，4和6天分别测量菌落直径和菌落中孢子圈直径，并观察描述菌落形态。每项实验重复2次。

    2、观察与结果

    实验结果表明，培养基酸碱度对臭曲霉菌株生长无显著影响。在PH值大于1至小于13的范围内均能正常生长菌丝和产生孢子。孢子形成的初始时间在不同PH值的培养条件下均基苯基本相似。孢子的生长速度则随PH值增大逐渐降低，在P H值4～7范围内生长较快。PH值为6生长最快。当PH值升为13时菌落的生长完全受到抑制。PH值3～8的范围内培养基中的菌丝体呈白色，酥松，生长迅速，孢子密集产生于菌落中部，于菌落成同心圆分布。待菌丝布满整个培养皿后，菌丝的顶部亦出现稀疏的孢子。PH值大于8则菌丝生长缓慢，排列紧密，前期孢子形成的速度慢，后期产生孢子的速度远远大于菌丝的生长速度，培养皿表面几乎看不到菌丝，只有稀疏的孢子覆盖于其上。

    2、2氮源对臭曲霉生长与形态的影响

    氮源试验结果表明，臭曲霉菌株在以硫酸铵(N5)或豆饼粉(N7)为氮源的培养基中生长迅速，在以蛋白陈(N1)，牛肉糕(N2)，酵母浸膏(N3)，硝酸钠(N4)和麸皮(N6)为氮源的培养基中生长相对缓慢。同时，氮源对菌落在培不基表明的形态有明显的影响。N1培养基中臭曲霉孢子呈黑色，菌丝乳白色，孢子与菌丝排列整齐的褶皱，在孢子圈与菌丝圈交界处出现金黄色圈。N2培养基中孢子呈黑色，菌丝呈乳白色，菌丝与孢子排列整齐，菌落周围的菌丝体致密且紧贴培养基表面，孢子形成的速度几乎接近于菌丝体生长的速度。菌落背乳白色，具整齐细密的辐射沟纹。在N3培养基中，孢子呈黑色，菌丝白色，孢子圈排列整齐，菌丝排列酥松且不整齐。菌落背面乳白色，具细密的沟纹。N4培养基使孢子呈黑褐色，菌丝白色，孢子及丝排列整齐，孢子形成的速度远慢于菌丝生长速度，菌落背面乳白色，具细密的沟纹。N5培养基中孢子呈黑色，菌丝白色，孢子排列整齐，菌落周围为排列不整齐的棉絮状的菌丝体，菌落背面乳白色，具细密的沟纹。N6培养基的孢子呈黑色，菌丝白色，菌丝与孢子排列整齐，菌丝排列酥松。菌落背面乳白色，无沟纹。在N7培养基中，孢子形成速度快，从菌落中可见黑色孢子层，孢子排列整齐，无分泌物，菌落背面白色、平整、光滑无沟纹。

    2、3碳源对臭曲霉生长与形态的影响

    碳源实验结果表明，玉米粉(C3)和果糖(C4)培养基对臭曲霉菌株的生产最为有利。同时，不同的碳源培养基对菌株的形态也有一定的影响。在蔗糖(C1)培养基中孢子呈黑色，菌丝呈白色，孢子形成速度中等，孢子圈排列整齐，菌丝呈现绒状、酥松，排列整齐；菌落中央的孢子圈少有下陷，正面具均匀、规则、细密的辐射状沟纹，背面浅黄色，也具均匀，规则、细密的辐射状沟纹。麦芽糖(C2)培养基中菌落的形态特征与在C1中相似。在玉米粉(C3)培养基中，孢子呈黑色，菌丝为白色，孢子形成的速度较慢，孢子圈排列整齐，菌丝呈丝绒状，酥松，排列整齐；菌落具沟纹，背面浅黄色，具少了沟纹。在d-果糖(C4)培养基中，菌株的孢子呈黑色，菌丝为乳白色，孢子形成速度快，孢子圈排列整齐，菌丝紧密、排列整齐；菌落正面具均匀、规则、细密且较深的辐射状沟纹在a-乳糖(C5)培养基中，菌株的孢子呈黑色，菌丝为白色，孢子形成相对较慢，孢子圈排列整齐，菌丝呈丝绒状，酥松，排列整齐；菌落无辐射状沟纹，背面浅黄色也无辐射状沟纹。

2、4温度对臭曲霉生长的影响温度实验结果表明，在培养温度为30℃的菌株生长最好，孢子形成速度和菌丝生长速度均最快。培养温度降低到20℃时生长最慢，升温至60℃时菌株死亡。

    3、讨论

    臭曲霉属半知菌亚门（Deuteromycotina）丝孢纲（Hyphomycetes）丝孢目（Hyphomycetales）丛梗孢科（Moniliaceae）曲霉属（Aspergillus）真菌，在自然界不多见，无毒，富含单宁酶等生物酶，具有降解水解单宁，产生没食子酸，形成深红色的作用〔Van Diepeningen等，2004〕。我们首次从普洱茶首次过程中分离到的臭曲霉菌株为普洱茶的优势菌物之一。生物学特征实验结果表明，该菌株在PH值2～13范围内均能正常生长，孢子形成的初始时间相同，对酸碱度的适应性较强，符合曲霉属真菌通常对PH值的广幅适应性〔黄福新等2005〕。该菌株在中性偏酸的培养条件下生长迅速。菌丝体呈白色，产生黑色孢子，孢子圈排列整齐，菌丝酥松且排列整齐，偶有排列紧密，菌落背面白色或乳白色，一般均有辐射状排列细密的沟纹。在不同碳源培养基中菌落形态坏死呈现一定的差异。上述观察结果与齐祖同〔1997〕在中国真菌志中描述的臭曲霉菌落形态有所差异。这可能与菌株来源与培养基不同有关〔靖德宾等2004〕。实验结果表明，该臭曲霉菌株在玉米粉或果糖培养基中，以硫酸铵或豆饼粉为氮源，PH值在6～7的范围内，培养温度为30℃时，生长最为旺盛。

    鉴于该菌株为普洱茶后发酵首次中的主要优势菌物之一，以上的实验有机结果将为菌株的大量制备，“普洱茶麴”的研制提供关键的技术基层。在普洱茶的规范生产、质量稳定和风味品牌的形成中具有重要的意义。